摘要：2013年8—9月，四川雅安汉源湖养殖的西伯利亚鲟发生一种以体表溃疡、内脏出血和心外膜囊肿为特征的传染病。为明确其病因，本研究从自然发病鱼的肝、脾和肾进行了病原菌的分离、人工感染、分离菌的表型特征和药物敏感性的检测。结果从患病鱼体内分离到一株G+链状球菌（Ab130920），人工感染实验证实了其病原性，生理生化特性与海豚链球菌（ATCC29178）基本一致；16S rDNA序列（GenBank登录号：KJ162337）与GenBank中海豚链球菌（S. iniae ）16S rDNA序列同源性最高，在以16S rDNA序列及其GenBank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上，分离菌与海豚链球菌聚为一族。进一步确定这分离菌株为海豚链球菌。药物敏感性试验发现其对氟苯尼考、强力霉素、阿莫西林等抗菌药物敏感，但对新生霉素、利福平、氧氟沙星耐药。
关键词：西伯利亚鲟；海豚链球菌；分离；鉴定
海豚链球菌（Streptococcus iniae）是一种圆形或近圆形、呈链状或呈双排列的革兰氏阳性球菌，由Pier和Madin首次从美国旧金山市某水族馆一头亚马逊淡水海豚皮下脓肿中分离并定种[1]，现已成为有鳍鱼类重要的病原菌。据报道，海豚链球菌也可感染人类，迄今至少有25例人感染并表现出临床症状[2-3]，主要表现为蜂窝织炎、菌血症、关节炎和脑膜炎[4]。如果患者本身具有心脏病、肾病、糖尿病和关节炎再感染上链球菌,将会更加严重。在水生动物上，国内外学者相继有虹鳟（Onchorynchus mykiss）[5]、罗非鱼（Oreochromis speices）[6]、澳洲肺鱼（barramundi）[7] 、美国红鱼（Sciaenopsocellatus）[8]等27余种淡水和海水养殖鱼类感染海豚链球菌并致病的报道。至此，人们逐渐意识到海豚链球菌对水生动物和人类造成的威胁。然而迄今为止，尚未见关于海豚链球菌感染西伯利亚鲟引起死亡的报道，本文关于海豚链球菌感染西伯利亚鲟尚属首次报道。
西伯利亚鲟，属鲟形目（Acipenseriformes），鲟科（Acipenseridae），鲟属（Acipenser），1996年首次引入中国，因其具有生长速度快，适应性强，肉厚骨软，营养丰富，味道鲜美和鱼籽酱品质高等优点，已成为我国目前鲟鱼养殖的主导品种之一。但随着养殖规模和养殖密度扩大，养殖环境的不断恶化，疾病对鲟鱼养殖业的影响日趋严重，已有寄生虫病、细菌性病、病毒性病的报道，尤以细菌性病的危害较大。目前报道的主要有嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）[9]、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii），豚鼠气单胞菌（Aeromonas carvia），停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）[10]和海豚链球菌（Streptococcus iniae）等引起的相关疾病。而2013年8-9月，在四川雅安汉源湖养殖的西伯利亚鲟发生一种以体表溃疡、内脏出血和心外膜上囊肿为特征的传染性疾病，累计死亡率达40%以上，给养殖户造成严重的经济损失。本研究从自然发病鱼体内进行了病原菌的分离，并通过表型特征测定、16S rDNA序列和进化分析鉴定其为S. iniae；同时进行了病原菌药物敏感性的检测，以期为该病的有效防治与致病机制探讨提供参考。 1.1 实验材料
患病西伯利亚鲟，体质量500~1 000 g，由四川雅安汉源湖某养殖场送检；健康西伯利亚鲟，体质量（152±6.7）g，购于四川峨眉某西伯利亚鲟养殖场；PCR产物纯化试剂盒、细菌DNA提取试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司，并且PCR扩增到1500bp左右的片段；细菌生化微量鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；药敏实验的药敏纸片则由杭州天和微生物试剂有限公司提供。
1.2 病原菌的分离纯化
无菌条件下，取样于患病西伯利亚鲟的肝、肾、脾等组织，划线接种于BHI琼脂培养基，28℃下培养24-48 h后观察细菌形态待征。挑取长势优良，形态均一的菌落，进一步培养纯化，获得纯化菌株。
1.3 人工感染实验
健康西伯利亚鲟于水族缸中暂养7d后，每组10尾鱼，分为5组，试验组编号依次为1到5组，其中第5组为对照组。将分离纯化细菌接种于BHI液体试管，28℃培养48h后，用无菌生理盐水配制成细菌悬液，稀释成4个浓度，分别为1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108 cfu/mL。注射剂量为0.2mL/尾，对照组注射等量无菌生理盐水。每天观察和记录实验鱼情况，并对死亡鱼或濒死鱼剖检取肝脏、脾脏进行病原菌接种分离。
1.4 形态学观察及生理生化鉴定
观察分离菌的菌落形态，革兰氏染色与磷钨酸负染镜检观察细菌形态。并取l株纯化分离菌的培养物，接种于BHI琼脂培养基上，28℃培养24 h，观察琼脂培养基上的菌落形态。挑取单个菌落接种于微量生化管中，28℃下培养24～48 h，参照《常见细菌系统鉴定手册》[11]和《伯杰细菌鉴定手册》[12]进行生理生化特性鉴定。
1.5 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析
用DNA提取试剂盒（大连宝生物工程有限公司）取对数生长期的新鲜菌液离心收集的菌体，按照试剂盒说明书提取DNA。采用细菌16S rRNA序列扩增的通用引物（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，5’-TACGGCTACCTTGTTACG-3’） ，对培养基细菌进行PCR扩增到1500bp左右的片段。PCR反应程序为：94℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃2min，30个循环；最后72℃延伸10min。由1%的琼脂糖凝胶电泳检测后观察结果，扩增产物送由生工生物工程（上海）有限公司测序。将测序结果与 GenBank中已知的基因片段进行 Blast 比对，选取与该序列相关性较高的基因序列，使用MEGA5.0构建系统发育树。
1.6 药敏实验
参照NCCLS抗微生物药物敏感性试验执行标准采用纸片法进行，将培养24h的细菌培养物以麦氏比浊法将菌液制成1.5×108 cfu/mL，取100μL菌液涂布于BHI培养基平板，待干燥后轻轻贴上药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司），28℃恒温培养48 h后测量抑菌圈直径的大小[13]。
- 结果与分析
患病鱼临床表现为嗜睡或水中异常游动,体色变深, 突然发生死亡。患病鱼背部溃烂（图1A），鳍条基部出血（图1B），肛门红肿出血（图1C）。剖解见肝发白，弥散性点状出血（图1D）；脾脏肿大，明显出血（图1E）；胰脏肿大，出血（图1F）。
图1：患病鲟鱼主要病症
A背部溃疡；B鳍条基部出血；C肛门红肿出血；D肝发白，弥散性点状出血；E脾脏肿大，明显出血；F胰脏肿大，出血。
Fig.1 Main clinical signs of affected Sturgeon
A. The back of the fish showed ucler B. The base of fin strip hemorrhage. C. Anus swelling and bleeding. D. petechial hemorrhage in paled liver. E. splenomegalia with congestion andhemorrhage. F. Pancreatic congestion and hemorrhagic.
2.2 病原菌分离纯化及人工感染
取患病西伯利亚鲟肝脏、肾脏和脾脏组织于BHI琼脂培养基上划线接种病原菌,经28℃恒温培养24h获得1株菌株Ab130920。菌株Ab130920经人工感染试验，显示其对西伯利亚鲟有较强致病力，结果见表1。在人工感染后，1组死亡1尾，2组死亡5尾，3组死亡8尾，最高浓度注射组鱼（4组）死亡10尾，死亡率达100%。人工感染后试验鱼发病症状同自然发病鱼且剖检可见类似病变，而对照组鱼健康不表现任何症状。从感染后的发病西伯利亚鲟肝脏中再次分离细菌，获得的菌落与菌株Ab130920形态特征一致，经鉴定其与Ab130920生物学特性相同，证明所分离菌为西伯利亚鲟的致病菌。
表 1 菌株Ab130920的人工感染试验结果
Table 1. Artificial infection results of the strain Ab130920
| 组别 | 病原浓度(cfu/ml) | 注射剂量(mL) | 死亡数(尾) | 死亡率(%) |
| 1 | 1.5×105 | 0.2 | 1 | 10 |
| 2 | 1.5×106 | 0.2 | 5 | 50 |
| 3 | 1.5×107 | 0.2 | 8 | 80 |
| 4 | 1.5×108 | 0.2 | 10 | 100 |
| 对照 | 生理盐水 | 0.2 | 0 | 0 |
分离菌株在BHI琼脂培养基上生长呈光滑、圆形、湿润、灰白色、不透明的小菌落，直径1～3 mm。革兰氏染色阳性，球形，呈单个或2个排列，少数排成3～4个的短链；无荚膜，无芽胞（图2、图3）。分离菌详细表型特征见表2。
图2 菌株Ab130920的革兰氏染色形态 图3菌株Ab130920负染电镜图（×10000），标
（×1000），标尺=10 μm 尺=1μm
Fig. 2 Micrograph of strain Ab130920 in Gram Fig. 3 Negatively stained electron micrographs
staining(×1000), bar=1μm of strain Ab130920 (×10000), bar=1μm
表 2 分离株Ab130920的生理生化特性
Table 2. Biochemical and physiological characteristics of isolated strain Ab130920
| 项目Item | 菌株 | |
| Ab130920 | S.iniae ATCC29178 | |
| 生长Growth | ||
| PH9.6 | - | - |
| 6.5%NaCl | - | - |
| 8.0 %NaCl | - | - |
| 10℃ | + | + |
| 45℃ | - | - |
| 水解Hydrolysis of | ||
| 精氨酸Arginine | - | - |
| 七叶苷Esculin | + | + |
| 马尿酸Hippurate | - | - |
| 氧化酶Oxidase | - | - |
| 过氧化氢酶Catalase | - | - |
| 产酸Acid from | ||
| 阿拉伯糖arabinose | - | - |
| 菊糖 Inulin | - | - |
| 乳糖lactose | - | - |
| 甘露醇mannitol | - | + |
| 棉籽糖raffinose | - | - |
| 核糖ribose | - | - |
| 山梨醇sorbitol | - | - |
| V-P 试验 V-P test | - | - |
Notes :“+” positive; “-” negative
2.4 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析
分离菌株Ab130920的16S rRNA基因经 PCR扩增后获得1500bp左右的片段，扩增产物送由生工生物工程（上海）有限公司测序，GenBank登录号为KJ162337。分离菌16S rDNA序列与GenBank中已知基因序列进行Blast比对，结果显示分离菌与GenBank上S.iniae的16S rRNA基因序列的同源性最高。在以分离菌16S rDNA序列及GenBank中其他海豚链球菌16S rDNA序列构建的系统发育树上（图4），分离菌与S.iniae聚为一族，同源性达 99.7%以上。
图 4. 菌株Ab130920 16S rRNA基因序列与相关菌株的系统发育树
Fig4. Phylogenetic tree of Ab130920 16S rRNA gene sequence and its relatives
2.5药敏试验
结果表明分离菌Ab130920对阿莫西林、氨苄青霉、头孢噻肟、强力霉素、卡那霉素、克林霉素、阿奇霉素、四环素、诺氟沙星、罗美沙星、恩诺沙星和氟苯尼考等抗菌药物敏感，对新生霉素、氧氟沙星、利福平和复方新诺明耐药。
表 3 分离株Ab130920的药物敏感性
Table 3. Antibiotics sensitivities of the isolated strain Ab130920
| 药物Drugs | 含药量/(μg/片) contents |
抑菌圈直径(mm) Diameter of inhibitory zone |
结果 |
| 阿莫西林amoxicillin | 10 | 20 | S |
| 氨苄青霉ampicillinum | 10 | 31 | S |
| 头孢噻肟claforan | 30 | 29 | S |
| 强力霉素deoxycycline | 30 | 38 | S |
| 卡那霉素kanamycin | 30 | 21 | S |
| 新生霉素novobiocin | 30 | 8 | R |
| 克林霉素clindamycin | 2 | 22 | S |
| 阿奇霉素azithromycin | 10 | 32 | S |
| 四环素tetracycline | 30 | 34 | S |
| 氧氟沙星ofloxacin | 5 | 9 | R |
| 诺氟沙星 norfloxacin | 10 | 21 | S |
| 罗美沙星 lomefloxacin | 18 | 23 | S |
| 恩诺沙星 enoxacin | 10 | 25 | S |
| 氟苯尼考florfenicol | 30 | 32 | S |
| 利福平rifampicin | 30 | 13 | R |
| 复方新诺明SMZ | 23.75 | 8 | R |
Notes: R resist ; S sensitive
- 结论与讨论
由于S. iniae不同的地理株系在生理生化特性上存在一定差异，如不同株在精氨酸双水解酶活性、乳糖、水杨苷发酵能力上有不同[17]，存在α和β两种溶血类型等[18]，S. iniae 最初也被错误地鉴定为S. shiloi[19]。而且目前很多商品化生化鉴定系统如BioMerieux Vitek，Microscan，APICH 50和ATB Expression System等并未将S.iniae列入其中[18, 20]，因此仅靠传统的细菌鉴定方法不能准确鉴定S.iniae。随着分子生物学的不断发展，16S rRNA序列分析已经成为研究细菌亲缘关系的常用方法之一。本研究中，将分离菌的16S rRNA序列与GenBank中已知的链球菌属16S rRNA基因片段进行Blast 比对，结果显示分离菌与GenBank上S.iniae的16S rRNA基因序列的同源性最高。在以分离菌16S rRNA序列及GenBank中其他海豚链球菌16S rRNA序列构建的系统发育树上，分离菌与S.iniae（ATCC29178）聚为一族，同源性达99.7%以上，进一步确定为海豚链球菌。
S. iniae感染不同的宿主所引起的临床症状不尽相同，在海豚主要表现为多灶性皮下脓肿[1]；在人类常引起蜂窝织炎，关节炎等[4]；在鱼类则可表现为全眼球炎、脑膜炎和败血症等[21]。本研究中发现S. iniae感染西伯利亚鲟主要表现为全身性多器官出血、变性、坏死和脑炎为病变特征（另文报道）的败血症表现，与其它鱼类S. iniae感染基本一致[21]，但本次发病鲟鱼心脏外膜出现大量米粒样大小的泡状囊肿的特征性病变，类似的现象在西伯利亚鲟停乳链球菌、维氏气单胞菌感染及在营养缺乏的基础上发生细菌继发感染中也有报道[22, 23]，而在其他种类的鲟鱼未见报道，究其发生的病理机制是否与西伯利亚鲟的种属特异性有关还有待进一步的研究。诸多学者对海豚链球菌的致病机制进行了研究，目前主要的观点是海豚链球菌的致病性是由黏附蛋白、溶血素和毒素等多种毒力因子共同作用的结果。其中溶血素S是链球菌的一种主要溶血性毒素，能够溶解淋巴细胞（lymphocytes, L），红细胞（erythrocytes, E）和白细胞（neutrophils, N）在感染西伯利亚鲟的病理损伤上表现出内脏器官的广泛出血，则可能与病原菌产生的溶血素S有关。
尽管，抗生素的使用在水生动物细菌性疾病的控制上起到了积极的作用，但抗生素的大量使用带来的诸如耐药性[24]、食物残留和环境污染等负面影响已不容忽视。研究中药敏试验结果显示，分离株S.iniae虽对大多数常用抗生素敏感，但是西伯利亚鲟一旦感染S.iniae后嗜睡或水中异常游动，这给采用口服抗生素的治疗带来困难；同时，由于S.iniae是一种人鱼共患的致病菌，且研究表明在细菌之间耐药基因可发生水平转移[25]，若大量耐药菌株出现在水产上也会极大的威胁到人类健康，所以仅靠使用抗生素来控制西伯利亚鲟的海豚链球菌的感染是远远不够的。为此，快速和早期的诊断方法、疫苗和免疫增强剂等的研究与应用已成为有效控制水生动物海豚链球菌感染的重要方向。
参考文献
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致谢
我要衷心的感谢xxx亲切关怀和悉心指导，我的毕业设计就不会进展地如此顺利。再次谨向所有关心和帮助我的老师、同学、朋友和亲人表示最诚挚的谢意。衷心地感谢各位专家、教授，感谢你们在百忙之中评阅我的学位论文并予以指导！
